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分子克隆及相关产品

发布时间:2019-12-27 点击数:

1 传统分子克隆
传统分子克隆依赖重组DNA方法,即首先通过限制性内切酶酶切,制备接受DNA插入片段的载体。随后,通过连接酶将酶切的片段拼接在一起(即连接过程),形成可以表达目标基因的新载体。这可能是传统克隆最简单、最老的技术,但也为研究人员开发各种新型克隆方法打下了基础,如TA cloning™、TOPO™克隆、PCR克隆、不依赖连接酶的克隆,以及利用其它修饰酶独特性能的基因组装。
传统分子克隆的一般实验流程包括如下步骤(图 1.1):

1.载体制备       2.插入片段制备       3.连接              4.转化              5.克隆筛选
图1.1 传统克隆流程


1.1载体制备
传统分子克隆方法所用的载体基于质粒,而后者为不依赖基因组DNA在细菌内复制的双链游离 DNA。所有基于质粒的克隆载体包含许多关键要素,包括:确保在细菌宿主细胞内能有效增殖的复制原;单一酶切位点,或更常见的是,含有多克隆位点(MCS),其含有一系列酶切位点,可插入目的片段;载体成功转化后的细菌筛选标记(例如,抗生素耐受)。
传统分子克隆载体制备的第一步是,通过限制性酶切构建插入位点。限制性内切酶的选择取决于载体和插入片段上是否存在相应的识别序列以及识别序列的位置,以及是否适于连接。MCS往往是插入片段的首选,因为该区域专用于克隆。
1.2插入片段制备
克隆的插入片段来源可能为基因组 DNA、另一质粒的一部分或者线性 DNA 片段。无论来源 DNA 类型如何,制备插入片段时常用PCR进行扩增,然后再纯化目的片段,进行限制性酶切,产生匹配的粘性末端,以便接下来将片段插入在载体中。
与载体制备一样,选择适于将插入片段克隆进载体的限制性内切酶。对此最通用的一种策略是,对插入片段和载体进行双酶切,以实现定向克隆。
1.3 连接
获得目标片段后,可以构建连接反应,连接插入片段和载体。连接最常用的酶为T4 DNA连接酶,可连接DNA末端的5′磷酸基和3′羟基。T4 DNA连接反应需要ATP、DTT和Mg2+,这些成分通常由反应缓冲液提供。为了改善连接结果,通常建议控制插入片段:载体摩尔比率,通常的比率范围为1:1至5:1。


2 同源重组法分子克隆
与传统连接方法相比,传统连接方法必须要有合适的酶切位点,且实际操作中经常会遇到酶切效率及连接效率不高等问题,致使靶基因片段插入载体相当困难,而同源重组法(图2.1)需考虑插入片段有没有酶切位点可用,它可以向几乎任何载体的任何位点进行定向克隆,不需要连接酶,用到的是重组酶,而且克隆的阳性率高。

图2.1 同源重组法构建载体


2.1 目的片段的获取
使用同源重组方法,根据不同的载体,设计不同的同源臂,即在目的基因的上游和下游引物5'端分别加上与载体的插入位点两端一致的20 bp左右的重复碱基序列。
纯化PCR产物,获取目的片段。
2.2 酶切载体
首先对载体进行单酶切或者双酶切,最终载体的浓度需>15ng/μl 。(高浓度的载体有利于提高效率),然后纯化酶切后的载体,与目的基因进行同源重组连接。
2.3 目的基因与载体重组
于冰盒上将目的片段与线性化载体以一定的摩尔比加入到离心管中进行重组反应,轻微混匀后,如不慎将液体粘到管壁上,可通过短暂低速离心使其沉入管底。反应结束可直接进行转化,也可储存在4℃或-20℃。

相关产品:T4连接酶(NEB、近岸),限制性内切酶(NEB、近岸),聚合酶(NEB、近岸),磷酸酶(NEB),核酸提取试剂盒(NEB、近岸)

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