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流式的基本原理

发布时间:2020-03-02 点击数:


流式的基本原理


A:何为流式细胞术?

流式细胞术(Flow Cytometry,简称FCM)是一种以流式细胞仪为检测手段,对单个微粒(通常是细胞)进行的一种快速、准确、客观、同时检测多参数,并可以对特定群体加以分选(需要流式仪具有分选功能)的技术。


研究的对象一般为生物颗粒:各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等。

检测的参数:主要分为三个参数

相对细胞大小(FSC)

相对细胞颗粒密度和内部复杂程度(SSC)

相对荧光强度


B、流式细胞仪的基本构成是怎样的?

流式细胞仪主要分为三大系统:

液流系统(聚焦细胞以供检测)


可以看出,上样速度会影响到样本流和鞘液流的压力差,它们的压力差越小,样本的上样速度越快。若是上样速度过快,会影响到单个细胞通过流动室,增加通道的CV值。对一些CV要求较高的实验,必须使用低速上样,以保证满足单个细胞通过流动室,得到较好的CV值。例如:一些倍数分析实验(细胞周期)等。


光学系统(激发和收集光信号)

激发光源:激光器和透镜,使激光束能集中于液流



可以看出,激光在液流处是平行排布的,所以不同激光分析同一个细胞的时候是存在时间延迟的。特别是分选的时候需要注意,调整好延迟以保证不同激光分析的是同一个细胞(后续分析板块会讲述到如何调整延迟),以保证分选的纯度。


信号接收:

FCM的光学系统由若干组透镜、滤光片和小孔组成,他们将不同波长的荧光信号分别送入到不同的电子测控器。主要的光学元件为:滤光片(Filter)。滤光片主要分为长通(只有大于该滤光片的波长可以透过)、短通(只有小于该滤光片的波长可以透过)和带通滤光片(只有满足滤光片范围的波长可以透过)。注意:带通滤光片的500/50500+/-25可以通过,也就是475~525nm的光可以透过。



BD仪器的收集系统为八棱镜全反射系统:(不同厂家的收集系统不太一样,不同型号的仪器也可能不一样,BD的八棱镜全反射系统为特有的专利收集系统)


从上图可以看出。一束完整的发射波长经过光纤导入到收集系统后,先由A通道的长通(LP)滤光片LP 750收集大于750nm的光(小于750nm的光全部经过全反射到达B通道),大于750nm的光由带通滤光片BP 780/60经过选择性接收750~810nm的发射光,也就是我们常用的PE-Cy7荧光。其余的通道反复如此……BD仪器为不同激光有独立的分析系统,488激光和640激光等都分别有独立的分析系统。其他厂家仪器可能不一样)


电子系统(将光信号转化为电信号,并使其具体数字化以供计算机分析)

光电检测器:光电二极管和光电倍增管(photomultiplier,PMT),将光信号转换成电子信号


前置放大电路:将信号等比例放大,输出电脉冲信号


数据处理系统:计算机系统数据采集与处理。将得到的信号处理为可视图等。


根据自己需要,选择不同的图形以满足实验需求即可。


小结:


C、检测参数:

散射光信号:物理信号,不依赖荧光染料。用于区分不同细胞群体的基本形态上的差异。

散射光信号不依赖任何样品的制备技术(如染色),因此成为细胞的物理参数。

前向散射叫(Forward Scatter,FSC:与细胞的大小及面积有关,在FCM应用钟,常取FSC做阈值,来排除样品中的各种碎片。

侧向散射角(Side ScatterSSC):与激光束正交90℃的散射光信号,与细胞粒度及细胞器复杂程度正相关。


上图三:可以看出通过散射信号,可以区分裂解红细胞后的粒细胞群、单核细胞群、淋巴细胞群。


荧光信号:需要标记相应的荧光染料。检测现有抗原的表达量。





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