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流式实验步骤

发布时间:2020-03-03 点击数:

流式实验步骤

1.流式表面染色实验步骤


CD45/CD3/CD4/CD8染色为例。

流式分析的样本,必须为单细胞悬液。无论什么样本,均必须制备成单细胞悬液后,再往后续实验。首先,比较常用的样本为全血(需裂解红细胞)、培养细胞、购买细胞株、灌洗液、不同组织(不同的组织根据需要制备成相应的单细胞悬液)


下述实验步骤以人外周全血为例:

A、取新鲜人外周全血200ul(若是PBMC1*10^6cells100ul Stain Buffer 554656/554657);

B、加入适量的流式抗体(CD45/CD3/CD4/CD8),室温避光孵育15min4℃、30min);

C、加入2mL 1X红细胞裂解液(555899)混匀,室温避光裂解15min(看具体时间而定,至澄清透亮即可);

D250g5min离心,弃上清,加入2mL Stain Buffer混匀细胞;

E250g5min离心,弃上清(如果红细胞碎片依然较多,可再清洗一遍);

F、加入300~500ul Stain Buffer混匀,上机检测,数据分析。


若死细胞过多或者新制备的组织样本,请使用细胞滤网过滤然后上机,防止细胞聚团(组织块)堵塞流式仪。


2.、流式胞内染色实验步骤


A、非分泌性蛋白检测

以人PBMCCD3CD8Granzyme B(胞内蛋白)为例。使用的破膜试剂为BD554714(使用前请按照说明书配置成工作浓度)

 

1*10^6cells100ul Stain Buffer混匀;

加入适量的流式抗体(CD3/CD8),室温避光15min进行表面抗体孵育;

加入2mLStain Buffer,混匀,500g5min离心弃上清;(两遍)

加入500ul Fixation/Permeabilization Solution 室温、20min;

500g5min离心,弃上清

加入2mL 1X Perm/Wash Buffer混匀,室温避光孵育10min500g5min离心弃上清;

加入100ul 1X Perm/Wash Buffer混匀,并加入适量抗体(Granzyme B),室温避光孵育30min;

2mL 1X Perm/Wash Buffer重悬,500g5min离心弃上清;(两遍)

使用300~500ulStain Buffer重悬细胞,上机检测,分析。

 

B、分泌蛋白检测

以人外周血检测Th1/2/17实验为例

1、制备好单细胞悬液;

2、每管10^6cells/mL,加入2~3ul(可根据预实验结果调节细胞浓度和刺激剂的量)刺激剂(550583)混匀,置于37℃培养箱中4~6小时进行刺激阻断;

3、使用PBS(无FBS/BSA等外源生物蛋白)重悬单细胞悬液至浓度1*10^7cells/mL,并加入死活染料(FVS7801ul(详见说明书)混匀,室温避光孵育10~15min;

4、使用2mL Stain BufferPBS+2~20% BSA)混匀细胞,350g,5min离心弃上清;

5、使用2mL Stain BufferPBS+2~20% BSA)混匀细胞,350g,5min离心弃上清;

6、使用100ul Stain BufferPBS+2~20% BSA)重悬混匀细胞,加入1ug FC Block1ug/10^6cells/100ul),4℃混匀避光孵育5~10min;

7、分别加入相应体积的流式抗体(可提前做成Cocktail,保证每管的体系约为10^6cells/100ul进行流式抗体的孵育),室温避光孵育15min(如若有同型对照,可一样操作);

8、使用2mL Stain BufferPBS+2~20% BSA)混匀细胞,350g,5min离心弃上清;

9、使用2mL Stain BufferPBS+2~20% BSA)混匀细胞,350g,5min离心弃上清;

10、使用554714对细胞进行固定破膜(按照说明书配置好相应的试剂,或参照英文说明书更好)

A、加入500ulFixation/Perm,混匀,并室温避光孵育20min500g,5min离心弃上清;

B、加入2mLPerm/Wash混匀,并室温避光孵育10min。500g,5min离心弃上清;

C、使用100ulPerm/Wash混匀,并加入适当的胞内流式抗体,室温避光孵育30min;

D、加入2mLPerm/Wash混匀,500g,5min离心弃上清;

E、加入300~500ulStain Buffer混匀,并上机检测。

 

3、核内蛋白检测

以人PBMCCD3/CD4/CD25/FOXP3(核内转录因子)为例。使用破核剂为562574(使用前按照说明书配置成工作浓度)

 

1*10^6 cellsPBMC,混匀在100ulStain Buffer中;

加入适量的表面抗体(CD3/CD4/CD25),室温避光孵育15min;

加入2mLStain Buffer混匀,500g5min离心弃上清;(两遍)

加入1mL1X Fix/Perm Buffer混匀,在4℃孵育40~50min;

加入1mL1X Perm/Wash Buffer混匀,350g,6min离心弃上清;

加入2mL1X Perm/Wash Buffer混匀,350g,6min离心弃上清;

加入80~100ul1X Perm/Wash Buffer,并加入适量的核内流式抗体,4℃避光孵育40~50min;

加入2mL1X Perm/Wash Buffer混匀,350g,6min离心弃上清;

加入2mL1X Perm/Wash Buffer混匀,350g,6min离心弃上清;

加入300~500ulStain Bufefr混匀,上机检测


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